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沙眼衣原体感染的实验室诊断

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    诊断沙眼衣原体感染常用的实验室方法有以下几种:①标本涂片染色直接镜检;②细胞培养法;③抗原检测试验,包括直接免疫荧光法和酶联免疫吸附试验;④DNA杂交及聚合酶链反应(PCR)法;⑤血清抗体检测。

     (一) 标本涂片染色直接镜检
    将临床标本涂片后,作姬姆萨染色、碘染色或帕氏染色,镜下观察。这是一种简便、价廉的诊断方法,可用于新生儿眼结膜刮片的检查,但它不适宜用于泌尿生殖道沙眼衣原体感染的诊断,因为在这种情况下,它的敏感性和特异性均极低。

     (二) 细胞培养法
    此法是目前检测沙眼衣原体感染最为敏感和特异的方法,在有经验的实验室,敏感性为70%~95%。此法可用作证实试验和治疗后的判愈试验。缺点是耗时、费钱,需一定的实验设备,不过大批量标本同时处理可降低成本。
作细胞培养取材很重要。对女性患者,一般取宫颈管标本,方法是先用一根长棉拭擦去宫颈表面粘液,弃去; 再用另一根长棉拭插入宫颈管1~2cm处,捻转数圈,停留10秒后取出送检。作沙眼衣原体检查时,拭子标本放入标本运送液中,-85℃低温冰箱保存待用。对于新生儿眼炎或肺炎,也可取结膜刮片标本及痰液、支气管洗出液等。

     (三)直接免疫荧光法
    针对沙眼衣原体主要外膜蛋白(Syva,Difco,Kallestad 的产品 )或脂多糖(Bartels,Boots Celltech,Califonia Integrated Diagnostic的产品)的单克隆抗体与相应的抗原结合,单克隆抗体标有荧光素,在荧光显微镜下,阳性者可见到亮苹果绿的原体和始体。此法诊断沙眼衣原体感染的敏感性为70%~90%,特异性为83%~99%。由于有可能将某些发光颗粒(白细胞、上皮细胞、色素颗粒)、细菌和酵母菌误认为沙眼衣原体,因此此法对于实验人员的技术水平要求较高。
直接免疫荧光法的优点是:快速,价廉,操作简便,标本的贮存和运送方便,标本中的沙眼衣原体不必是存活的或是有感染性的。由于已经有商品化的试剂盒供应,因而方便了使用。缺点是在低感染率的人群中敏感性差,受实验人员的主观影响大。它最适宜用来检测沙眼衣原体高流行率人群(如性病门诊病人)。

     (四)酶联免疫吸附试验
    将沙眼衣原体抗体致敏聚苯乙烯小珠 ( Chlamydiazyme,为Abbott的产品)或包被微量板孔(IDEIA,为 Boots Celltech 的产品;Pathfinder,为Kallestad的产品),捕获标本中的沙眼衣原体抗原,通过酶联显色反应而判断结果。此法诊断沙眼衣原体感染的敏感性与直接免疫荧光法相当,而特异性稍有不如(90%左右)。试验结果阴性时,不能完全排除沙眼衣原体感染,有可能是沙眼衣原体数量不足或标本采集不当的缘故。
此法的一个显著优点是自动化程度高,可同时检测大批量标本,结果判断客观性强。它与直接免疫荧光法一样,最适宜用来检测沙眼衣原体高流行率人群。在低流行率的人群中应用时,解释结果宜慎重。

     (五)胶体金免疫扩散试验

    在两块长方形塑板中衬有检测滤纸条,滤纸条上吸附有抗沙眼衣原体单克隆抗体。在塑板的"样本窗"加样,通过毛细作用,渗入"结果窗",如为阳性则见细线形成。此法诊断女性宫颈沙眼衣原体感染的敏感性为87%,特异性为98.8%。此法的优点是简易,方便,快速,尤其适用于基层单位。缺点是标本中需要足够数量的沙眼衣原体抗原。目前厂家仅推荐用于诊断女性生殖道沙眼衣原体感染。

     (六)血清抗体检测
    尽管沙眼衣原体感染时血清和泌尿生殖道分泌液中会出现抗体,但血清学试验对于诊断无并发症的泌尿生殖道感染价值不大。免疫反应为期短暂,且再感染常有发生。血清抗体在性病高危人群中有较高的本底检出率。不过,在性病性淋巴肉芽肿(LGV)和沙眼衣原体性附睾炎、输卵管炎时血清抗体水平明显升高,检测血清抗体水平有助于诊断。新生儿衣原体肺炎也可用血清学方法测定抗衣原体IgM抗体,具有诊断价值。方法有酶联免疫吸附试验和微量免疫荧光法,后者的操作较繁琐,不过,目前已有简化的L2抗原免疫荧光试验。Orgenics的Immunocomb和Bio Merieux的MicroEIA均是酶联免疫吸附法,所不同的是前者是将抗原包被于塑料梳齿上,后者则是包被于微量板孔中。当抗体滴度达一定水平( 如女性≥1:128,男性≥1:64)时,提示有并发症(附睾炎或输卵管炎),或为LGV。 由于沙眼衣原体感染后血清阳转需2~3周时间,因此抗沙眼衣原体IgG检测阴性不能完全排除感染。 而病人即便经治疗后,IgG升高仍能持续较长时间,故阳性结果也不一定证明有感染存在。

     (七)聚合酶链反应

    这是一种体外扩增特异DNA片段的方法, 用于诊断沙眼衣原体感染的PCR法已有商品化试剂盒(Amplicor C. trachomatis test)。PCR法诊断泌尿生殖道沙眼衣原体感染的敏感性高,在细胞培养阴性者亦能检测出沙眼衣原体感染。在一项比较研究中,PCR、培养和Gen-Probe的敏感性分别是95%、86%和65%。有研究发现, PCR的特异性达到99%~100%。一种PCR(以质粒DNA顺序为引物)阳性而培养阴性的标本可以用另一种PCR(以不同的质粒DNA顺序或主要外膜蛋白基因顺序为引物)证实,说明可能并非是PCR假阳性结果。然而,也有报告由于"残留(carry over)"污染而造成PCR假阳性,或因标本中含有Taq酶抑制物质而使PCR假阴性。在PCR反应体系中加入内参照可以发现假阴性问题;此时可将标本以反复冻融几次或冻存较长时间或稀释等方法来解决之。临床上,PCR的结果应该结合病史和治疗情况进行分析,必要时重复取材或在另一部位取材作试验。以沙眼衣原体主要外膜蛋白基因顺序为引物,进行PCR扩增,扩增产物以限制性内切酶酶切,分析酶切产物,即PCR-RFLP,可用于对沙眼衣原体进行分型。此种基因学分型结果与血清学分型结果基本一致。
LCR法也已用来检测沙眼衣原体感染。如,以沙眼衣原体隐蔽性质粒顺序为引物,利用LCR法检测718份尿液标本的沙眼衣原体,并与细胞培养法相比较。两者结果不一致时,再用DFA和另一种LCR(以沙眼衣原体主要外膜蛋白基因顺序为引物)加以验证。这样,观察到LCR的敏感性和特异性分别为94.5%和99.5%;阳性预期值和阴性预期值分别是97.5%和98.8%,而细胞培养的敏感性只有57.1%。LCR与PCR法均能一致扩增沙眼衣原体的DNA数量达3个衣原体原体水平。

    沙眼衣原体核酸扩增技术的另一进展是可用清晨首次尿(或禁尿4小时后的首次尿)作为标本。据报告,男性尿液标本以PCR或LCR作沙眼衣原体检测,敏感性为93.5%~100%,特异性为99.1%~100%,而尿道拭子培养的敏感性平均为68.2%。女性尿液标本以LCR检测沙眼衣原体的敏感性为95.7%,特异性为100%,而宫颈管拭子培养的敏感性为59.6%。由于尿液取材方便,对患者无侵害,因此这种方法适合于在不同人群中进行大规模筛查,也适合于边远地区标本采集后运送至中心实验室进行检测。
PCR实验在操作时,尤其要避免外界污染及残留污染,以免发生假阳性。PCR的开展需要一定的实验条件,实验人员需具备较为熟练的分子生物学操作技术。最好在实验条件较为成熟的实验室开展。

(王千秋)
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